HAD及非HAD患者中枢神经系统来源的HIV-1 Nef蛋白对U87细胞自噬的影响

更新时间:2023-05-28

【摘要】目的 研究HIV-1 Nef蛋白氨基酸位点变异对其抑制神经细胞自噬的影响,探讨Nef蛋白致中枢神经系统损伤的机制。方法 分别扩增和克隆1例HIV相关性痴呆(HIV－associated dementia,HAD)患者(H)及1例非AIDS HAD患者(N)中枢神经系统颞叶(temporal cortex,TC)部位的HIV-1nef基因,进行序列分析,研究氨基酸位点变异；构建H-TC和N-TC来源的Nef真核表达载体p EGFP-N1－nef,并分别转染U87细胞,观察绿色荧光蛋白并初步判断Nef蛋白表达情况；同时Western blot检测U87细胞Nef蛋白及细胞自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、p62蛋白的表达,分析不同来源的Nef对U87细胞自噬的影响。结果 PCR扩增并构建H-TC及N-TC nef基因克隆载体pMD-19T-nef,测序证实为HIV-1B亚型,氨基酸序列分析显示,H-TC与N-TC关键氨基酸位点存在差异；成功构建pEGFP-N1－nef重组质粒,在U87细胞内表达Nef蛋白,转染后48 h Nef蛋白表达量最高；Western blot结果分析表明,LC3-Ⅱ蛋白的表达量在组间的差异有统计学意义(F＝11.764,P＝0.001),两组细胞中LC3－Ⅱ含量较低,Western blot未能检测到。,空白组与空载体组之间LC3-Ⅱ的表达量差异无统计学意义(P＝0.169),H-TC、N-TC及阳性对照CQ组LC3-Ⅱ表达升高,与空白对照或空载体相比,差异具有统计学意义(P＝0.017,P＝0.039,P＝0.031),且H-TC组LC3-Ⅱ的表达量高于N-TC组(P＝0.023)；H-TC、N-TC及阳性对照CQ组p62蛋白的表达量较空白对照或空载体组有所升高,但组间差异无统计学意义(F＝2.049,P＝0.163)。结论 HAD及非HAD患者中枢神经系统中HIV-1 Nef氨基酸位点存在差异,对U87细胞自噬的影响也因此不同,H-TC来源的Nef诱导自噬标记蛋白LC3-Ⅱ表达的能力更强。

【关键词】 HIV相关性痴呆 HIV-1nef 自噬标记蛋白LC3-Ⅱ 自噬标记蛋白p62

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